縫隙連接（Gap junctions）又稱間隙連接，是一種重要的跨細胞通道，可以介導分子量小于約1 kD的小分子（如cAMP，IP3，Glucose等第二信使）或離子（氫離子、鈣離子、鉀離子等）在細胞間的擴散。這種通道廣泛地存在于包括脊椎動物和無脊椎動物的各類組織和器官中，介導細胞間的化學和電學信號傳遞，從而調控發育、維持穩態，保證生物體各個系統的正常工作。縫隙連接功能的缺陷與許多疾病有關，包括心肌梗死、聽力喪失和低髓鞘性疾病等。

連接蛋白存在于興奮和非興奮的組織中，除了分化的骨骼肌、紅細胞和成熟精子細胞之外的所有組織中都有表達。連接蛋白編碼基因的突變與多種遺傳疾病（包括耳聾、神經病、白內障、骨骼異常和皮膚病）的發生相關，它們調節免疫反應、細胞增殖、遷移、凋亡和癌變的能力使之成為多種疾病的治療靶點。

縫隙連接蛋白的形成和降解

已有研究證明連接蛋白在內質網中合成，在高爾基體中加工形成半通道。新合成的連接蛋白組裝成連接子，隨后被運輸并插入到質膜中。在細胞接觸過程中，連接子與對應細胞的連接子正面對接并聚集形成縫隙連接斑塊。一旦細胞間通訊不再需要縫隙連接斑塊，或細胞遷移，縫隙連接斑塊的一部分（通常是中心部分）或整個斑塊內化，形成環狀縫隙連接。環狀縫隙連接可以通過一系列過程降解，包括溶酶體、自噬體等過程。環狀縫隙連接囊泡或在環狀縫隙連接囊泡降解過程中釋放的連接蛋白可能會回到細胞表面循環利用，參與新的或現有縫隙連接斑塊的形成（圖4）。

縫隙連接的研究工具

縫隙連接在各種生理過程中發揮重要作用，而在復雜系統（神經系統）的生理或疾病條件下研究縫隙連接耦合需要一種既具有細胞特異性又具有高時空分辨率的非侵入性方法，然而以往用于監測縫隙連接的方法包括電生理記錄、染料微注射、熒光漂白恢復(FRAP)和分子熒光探針的局部激活（LAMP），均缺乏細胞特異性及高時空分辨率，并且具有侵入性，因此限制了它們的應用。

為了更好地研究縫隙連接在復雜系統中的分布及生理和病理條件下的功能，2019年，北京大學李毓龍課題組開發了一種新型的、可基因編碼的光遺傳學縫隙連接檢測探針——PARIS（pairing actuators and receivers to optically isolate gap junctions），并將其應用在細胞系、心肌細胞和轉基因果蠅的神經系統中重復地檢測特定細胞間的縫隙連接通訊。該方法首次實現了運用完全遺傳編碼的方法在特異的細胞類型中非侵入地對縫隙連接通訊進行成像，它結合了光學的高度時空操縱性和遺傳學的特異性，為研究縫隙連接通訊的在體分布、不同生理活動下的功能及調節提供了更多的可能性。

圖5. PARIS的作用原理示意圖

PARIS包含兩部分：第一部分是一個光控質子“泵”（ArchT），它將氫離子輸送出細胞；第二部分是一個熒光傳感器（質子敏感型熒光蛋白pHluorin，所用AdV-pHluorinCAAX腺病毒由維真生物提供），存在于接收信號的細胞內，它對流出的氫離子做出反應。將二者分別表達在縫隙連接耦合的細胞中，通過光激活質子泵產生跨細胞的質子梯度，再通過pHluorin的熒光變化檢測兩個相鄰細胞間的縫隙連接通訊（如圖5所示）。

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研究思路

部分研究結果

1、PARIS與FRAP（熒光漂白恢復技術）在HEK293T細胞中的功能比較

通過對PARIS與FRAP（基于染料擴散的方法檢測縫隙連接介導的光漂白后的熒光恢復）的比較發現，相同時間內PARIS信號比FRAP信號更加穩定，未曾出現衰減，而且PARIS信號的動力學比FRAP快速，對應的t_1/2分別約為~21s和~197s（圖6）。

圖6. PARIS與FRAP在HEK293T細胞中的比較

2、PARIS可檢測縫隙連接和由連接蛋白編碼基因突變引起的疾病

研究表明，磷酸化通過影響縫隙連接的組裝、降解和門控等途徑參與其調節。接下來，作者探討了PARIS是否可以在蛋白磷酸化等調節條件下檢測縫隙連接：用cAMP類似物8-Br-cAMP、腺苷酸環化酶激動劑Forskolin及蛋白激酶C（PKC）激動劑TPA處理表達PARIS的HEK293T細胞。與對照組相比，經TPA處理細胞后，PARIS信號受到顯著抑制，而8-Br-cAMP和Forskolin的處理對其未造成明顯影響，表明PKC的激活會抑制縫隙連接。

已知連接蛋白Cx43編碼基因GJA1的突變與許多疾病有關，那么PARIS是否可以用來檢測連接蛋白編碼基因突變引發的疾病呢？作者在不表達內源性連接蛋白的HeLa細胞中表達了PARIS，光激活“質子泵”細胞時，接收器細胞中未產生PARIS信號；而在表達GJA1的HeLa細胞中，光激活“質子泵”細胞時，相鄰接收器細胞中產生了強烈的熒光。由于Cx43編碼基因GJA1的突變影響了縫隙連接的形成，從而使PARIS信號顯著降低。上述結果表明，PARIS可用于檢測縫隙連接蛋白編碼基因突變造成的疾病（圖7）。

圖7. PARIS可檢測縫隙連接和由連接蛋白基因突變引起的疾病